We next studied the impact of S protein on mitochondrial function. Confocal images of ECs treated with S1 protein revealed increased mitochondrial fragmentation, indicating altered mitochondrial dynamics (Figure [C], i). To examine whether these mitochondrial changes were due, in part, to the decreased amount of ACE2, we overexpressed ACE2 S680D (ACE2-D, a phospho-mimetic ACE2 with increased stability) or S680L (ACE2-L, a dephospho-mimetic with decreased stability)4 in ECs. As shown in Figure [C], ii, ECs with ACE2-L had a higher number of fragmented mitochondria when compared to those with ACE2-D. Performing oxygen consumption rate and extracellular acidification rate assays, we found that ECs overexpressing ACE2-L had reduced basal mitochondrial respiration, ATP production, and maximal respiration compared to ECs overexpressing ACE2-D (Figure [D], i). Moreover, ACE2-L overexpression caused increased basal acidification rate, glucose-induced glycolysis, maximal glycolytic capacity, and glycolytic reserve (Figure [D], ii). Also, ECs incubated with S1 protein had attenuated mitochondrial function but increased glycolysis, when compared with control cells treated with IgG (Figure [D], iii and iv). We also compared the expressions of mitochondria- and glycolysis-related genes in lung ECs isolated from ACE2-D or ACE2-L knock-in mice.4 Shown in Figure [E], the mRNA levels of NRF1, HO1, and TFAM (mitochondria biogenesis-related genes) were increased, whereas those of HK2, PFKFB3, and ENO2 (glycolysis-related genes) were decreased in lung ECs in ACE2-D mice, as compared to those in ACE2-L mice.

Vi studerade sedan effekten av S-protein på mitokondriell funktion. Konfokala bilder av EC behandlade med S1-protein avslöjade ökad mitokondriell fragmentering, vilket indikerar förändrad mitokondriell dynamik (figur [C], i). För att undersöka om dessa mitokondriella förändringar delvis berodde på den minskade mängden ACE2 överuttryckte vi ACE2 S680D (ACE2-D, en fosfo-mimetisk ACE2 med ökad stabilitet) eller S680L (ACE2-L, en defosfo-mimetic med minskad stabilitet) 4 i EG. Som visas i figur [C], ii, hade EC med ACE2-L ett högre antal fragmenterade mitokondrier jämfört med de med ACE2-D. Genom att utföra syreförbrukningshastigheter och extracellulära försurningshastighetsanalyser fann vi att EC överuttrycker ACE2-L hade minskat basal mitokondriell andning, ATP-produktion och maximal andning jämfört med EC som överuttrycker ACE2-D (Figur [D], i). Dessutom orsakade ACE2-L-överuttryck ökad basal försurningshastighet, glukosinducerad glykolys, maximal glykolytisk kapacitet och glykolytisk reserv (figur [D], ii). Dessutom hade EC som inkuberats med S1-protein försvagat mitokondriell funktion men ökat glykolys jämfört med kontrollceller behandlade med IgG (figur [D], iii och iv).Vi jämförde också uttrycken av mitokondri- och glykolysrelaterade gener i lung-ECs isolerade från ACE2-D eller ACE2-L knock-in-möss.4 Visade i figur [E], mRNA-nivåerna av NRF1, HO1 och TFAM (mitokondrier biogenesrelaterade gener) ökade medan de för HK2, PFKFB3 och ENO2 (glykolysrelaterade gener) minskade i lung-ECs i ACE2-D-möss, jämfört med dem i ACE2-L-möss.